引言
隨著重組膠原蛋白賽道的持續(xù)火爆，作為最常用的親和標簽，His標簽在重組膠原蛋白研發(fā)生產(chǎn)中的應(yīng)用可謂舉足輕重?；诮M氨酸殘基與金屬離子（如Ni2+、Cu2+、Zn2+等）之間的螯合作用，固定化金屬親和層析（immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC）技術(shù)已成為 His 標記蛋白分離純化的首選方法。為應(yīng)對His標簽蛋白純化的需求，賽分科技推薦兩款瓊脂糖基質(zhì)的鎳親和填料Agarosix MC90-NTA Ni和Agarosix MC90-Ni Excel，具有非特異性吸附低、結(jié)合載量高和耐受性強等優(yōu)勢，可大大提升純化過程的效率和質(zhì)量。
產(chǎn)品介紹
常用的His標簽融合蛋白純化的填料有Ni-IDA、Ni-NTA（圖1左）和Ni-TED（圖1右）等金屬螯合親和填料。由于鎳離子（Ni2+）一共有6個配位點可以進行螯合配位，鎳離子與填料基質(zhì)螯合的配位數(shù)決定了填料的性能差異，實際生產(chǎn)中需要根據(jù)純化要求選擇合適的填料。
圖1. Ni-NTA和Ni-TED填料結(jié)構(gòu)示意圖
Agarosix MC90-NTA Ni和Agarosix MC90-Ni Excel是兩款以6%高交聯(lián)度瓊脂糖為基質(zhì)的金屬親和層析填料，填料表面具有高度親水性，最大程度地避免了與生物類樣品的非特異性吸附。Agarosix MC90-NTA Ni填料以次氮基三乙酸（NTA）為配體螯合鎳離子，His標簽蛋白的載量高于50 mg/mL，可耐受0.1 M NaOH清洗再生。Agarosix MC90-Ni Excel填料以三羧甲基乙二胺（TED）為配體螯合鎳離子，5個螯合位點使得其對于鎳離子具有很強的約束力，該填料可重復(fù)使用，無需補充鎳離子，可有效縮短純化工藝。詳細技術(shù)參數(shù)可見表1。
表1. Agarosix MC90-NTA Ni和Agarosix MC90-Ni Excel的技術(shù)參數(shù)
性能特點
1. 耐壓優(yōu)勢
對Agarosix MC90-Ni Excel進行壓力測試，如圖2結(jié)果顯示，常規(guī)線速度下（200-400 cm/h），在幾種常用的流動相中填料壓力表現(xiàn)良好，在0.6 bar左右。較高比例的有機相會導(dǎo)致壓力較高，20%乙醇保存時需留意流速對填料壓力的影響。
圖2. Agarosix MC90-Ni Excel壓力測試結(jié)果
2. EDTA耐受性
在100 mM EDTA條件下泡堿1 h， Agarosix MC90-Ni Excel的DBC為初始值的67.98%，競品Ni Excel下降至42.06%；相較而言，Agarosix MC90-Ni Excel具有更好的EDTA耐受性。
圖3. Agarosix MC90-Ni Excel對EDTA的耐受性測試
3. 耐堿性能
Agarosix MC90-Ni Excel與競品耐堿性能測試觀察DBC變化（具體數(shù)據(jù)見圖4），泡堿條件為1 M NaOH。泡堿測試模擬填料壽命實驗，一般CIP條件0.5 M堿洗5-6 CV，約30 min，泡堿48 h相當(dāng)于96次純化實驗CIP。Agarosix MC90-Ni Excel可保持在初始載量的80%左右，整體耐堿性能優(yōu)良。
圖4. Agarosix MC90-Ni Excel耐堿性能測試
應(yīng)用案例
某His標簽蛋白樣品純化實驗方案
層析柱信息：Agarosix MC90-Ni Excel（6.6*200 mm，CV=6.842 mL）
檢 測 器：UV 280 nm
樣 品：某His標簽蛋白發(fā)酵液
上 樣 量：40 mg/mL填料
圖5. Agarosix MC90-Ni Excel純化圖譜和電泳圖
（1.Marker; 2.原樣; 3.流穿; 4.后平衡; 5.柱沖洗; 6.洗脫）
Agarosix MC90-Ni Excel純化His標簽蛋白發(fā)酵液，樣品洗脫集中，無明顯拖尾，回收率為86.67%；從純化后樣品的電泳圖（圖5）分析可知，Agarosix MC90-Ni Excel洗脫后蛋白純度較高，純化效果較好。
小結(jié)
Agarosix MC90-NTA Ni填料的蛋白載量高，耐酸耐堿，可耐受0.1 M NaOH清洗再生。適用于原核蛋白表達料液中不含EDTA、DTT等還原劑或螯合劑——重組蛋白、酶、生長激素類。
Agarosix MC90-Ni Excel填料具有優(yōu)異的DTT和EDTA耐受性，可重復(fù)使用100 次以上，每次使用后可以直接用0.5 M NaOH溶液在線清洗，無需補充鎳離子，且耐堿性能較好，使用壽命較長，可縮短純化工藝，有效降低成本。適用于真核體系表達料液中含EDTA、DTT等還原劑或螯合劑——重組蛋白、酶、生長激素類。
訂購信息
注：包裝規(guī)格為1L，5 L, 10 L, 50 L，預(yù)裝柱規(guī)格為1mL, 4.2mL, 5 mL。
上一篇ADC藥物純化解決策略
