引言
日常的液相實驗操作中,流動相配制是實驗技術(shù)人員需要掌握的基礎(chǔ)。流動相的選擇和配制不僅影響樣品的溶解度和分離效果,還直接關(guān)系到色譜柱的壽命和儀器的使用性能。因此,掌握流動相的配制技巧對于獲得準(zhǔn)確的色譜分析結(jié)果至關(guān)重要。
本期我們以體積排阻色譜(Size-Exclusion Chromatography,SEC)為例,與大家分享一些流動相配制方面的技巧小貼士,幫助大家獲得穩(wěn)定可靠的分析結(jié)果。
流動相選擇
生物大分子的SEC方法,最常用的流動相是磷酸緩沖鹽。通常情況下,SEC的分離效果不受流動相的影響。若峰形受到靜電吸附作用及疏水作用的影響,造成拖尾或出峰異常等現(xiàn)象,則可以在流動相中加入高鹽或有機(jī)試劑來進(jìn)行改善。常用的有機(jī)試劑包括:異丙醇、乙腈等。
選擇要點
1.樣品在選用的流動相中有較好的溶解性和穩(wěn)定性;
2.流動相需在色譜柱的耐受范圍內(nèi)使用,包括流動相的pH、有機(jī)相比例等。通常硅膠基質(zhì)的SEC色譜柱,耐受流動相的pH范圍為2.0~8.0,如需在緩沖鹽中加入有機(jī)試劑,有機(jī)試劑的添加比例需控制在20%以內(nèi)。
配制步驟
1.150mM PB緩沖鹽:
稱取Na?HPO?·12H?O 62.01g和NaH?PO?·2H?O 19.795g置于2L燒杯中,加入2000mL超純水。用磷酸或氫氧化鈉溶液微調(diào)至pH7.0,抽濾。
2.150mM PB緩沖鹽+5%異丙醇(體積比):
按上述方法配制150mM PB緩沖鹽(pH7.0)950mL,加入50mL異丙醇,超聲15min?;旌暇鶆?,現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.20mM PB緩沖鹽+250mM NaCl:
稱取NaH?PO?·2H?O 1.59g和Na?HPO?·12H?O 3.51g以及NaCl 14.61g ,加入1000mL超純水,微調(diào)至pH7.0,抽濾 。
4.如需其他pH磷酸鹽緩沖液,可以參考以下配比表,根據(jù)實際需求進(jìn)行配制。
表1.不同pH的磷酸鹽緩沖液配制表
*A液:0.2M NaH?PO?水溶液;B液:0.2M Na?HPO?水溶液
注意事項
1.當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)原為緩沖鹽溶液需替換為高有機(jī)相比例(純)溶劑或系統(tǒng)內(nèi)原為高有機(jī)相比例(純)溶劑需替換為緩沖鹽溶液時,必須先用純水或低有機(jī)相比例溶劑(如小于20%有機(jī)相)過渡。過渡時,通常設(shè)定流速為實驗流速的一半,沖洗2倍柱體積。
2.流動相最好現(xiàn)配現(xiàn)用:乙腈揮發(fā)快,易導(dǎo)致有機(jī)相比例變化;磷酸鹽緩沖液易長霉長菌。
3.流動相一般貯存在玻璃、聚四氟乙烯容器中,不能用塑料容器貯存。
4 緩沖鹽流動相連續(xù)使用一般不超過兩天。
實驗要領(lǐng)
1.過濾和脫氣:
將配制好的無機(jī)鹽緩沖液通過0.45μm或更小孔徑水系濾膜進(jìn)行過濾,以去除其中的不溶性顆粒。同時,使用超聲波或真空脫氣機(jī)對流動相進(jìn)行脫氣,以消除其中的氣泡,確保色譜分析的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
2.調(diào)整pH:
合適的pH值有助于改善樣品的溶解性和分離效果。通常SEC色譜柱流動相需要保持在pH7.0中。
3.色譜柱保存:
若長期不用時,SEC色譜柱建議保存在含0.02%NaN3的150mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)或20%乙醇中,以防止菌體污染。
產(chǎn)品介紹
在建立SEC方法時,需根據(jù)樣品分子量大小、尺寸大小等信息,選擇合適孔徑的色譜柱,此外要根據(jù)分離目的,選擇合適的粒徑和填料工藝。賽分科技SEC系列色譜柱,采用特有的表面修飾技術(shù),分離速度快,分辨率高,是分析型SEC值得信賴的產(chǎn)品。
圖1.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝
“-C”系列產(chǎn)品,采用賽分科技獨有的固定相修飾工藝,硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層,最大程度減少非特異性相互作用。適用于疏水性較強(qiáng)的樣品,可以減少有機(jī)相的使用,“-C”系列產(chǎn)品安全、環(huán)保,讓您的實驗無后顧之憂。
賽分科技SEC系列色譜柱,分離范圍廣,適用于多種細(xì)分領(lǐng)域,下表是部分產(chǎn)品的分離范圍。
表2.賽分科技SEC色譜柱分離范圍