引言
糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白參與較多生物學過程，如膜相關酶活性、細胞信號轉導、細胞粘附和抗原呈遞等。GPI錨定蛋白生物合成過程的異常通常引發(fā)多種疾病，如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、智力障礙和癲癇發(fā)作等。
2024年1月，中科院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心(上海生化細胞所)與復旦大學生物醫(yī)學研究院/附屬口腔醫(yī)院屈前輝課題組在《Nature Communications》發(fā)表了Molecular basis of the inositol deacylase PGAP1 involved in quality control of GPI-AP biogenesis的研究論文(點擊文末閱讀原文查詢文章)。文中利用高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)結合耐熱綠色熒光蛋白(TGP)表達，設計了一種基于熒光檢測體積排阻色譜(FSEC)的耦合分析方法。這種方法使用賽分科技產品Zenix-C SEC-300體積排阻色譜柱，實現了脂質重塑酶PGAP1底物(TGP3)和最終產物(TGP0)的分離，具有高靈敏度、可重復性和便利性。
背景介紹
在哺乳動物細胞中，糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI-APs)在細胞信號轉導、細胞黏附、催化等方面發(fā)揮重要作用，其合成缺陷導致嚴重的先天性神經發(fā)育紊亂。GPI-APs途徑包括合成與重塑兩個階段，涉及20多步膜內催化反應。因此，需要闡明這一重要的翻譯后修飾生物發(fā)生過程的分子機制，以助力其特異性靶向藥物研發(fā)。
目前，對含有GPI的底物/產物的分析主要依賴于半定量方法，如薄層色譜或SDS-PAGE。但由于GPI-APs脂肪酶成分復雜，該方法有一定局限性。因此研究團隊設計了一種基于熒光檢測體積排阻色譜(FSEC)的耦合分析方法，可以實現PGAP1底物和最終產物的分離。
文章概述
GPI-APs的分泌和質量控制需要由進化上保守的PGAP1啟動的附著后重塑。研究團隊設計了一種基于熒光的新型、簡便、靈敏的生化分析方法，對其酶學性質進行了表征，并采用哺乳細胞與酵母細胞水平的活性體系對其功能進行了鑒定。繼而通過細胞工程方法，捕捉PGAP1與GPI錨定蛋白的復合物，并采用冷凍電鏡手段，分析了三個PGAP1在脂環(huán)境及與產物復合物的高分辨率結構(2.66−2.84Å)，解析了其10-跨膜結構和產物-酶相互作用的機理，揭示了PGAP1介導GPI-AP脂質重塑過程的分子機制，對于進一步深入理解減數分裂重組形成過程有著十分重要的意義。
文章選用賽分科技Zenix-C SEC-300體積排阻色譜柱，利用SEC-HPLC系統(tǒng)與TGP熒光相結合的方式，實現了PGAP1底物和最終產物的分離，在GPI研究領域潛力巨大。
產物檢測
將混合物在4°C下以21,000g離心10分鐘，然后采用Zenix-C SEC-300(3μm,300Å)色譜柱進行上樣。在482/508nm波長進行熒光檢測體積排阻色譜(FSEC)的監(jiān)測。TGP0(產物)可以通過使用已知量的TGP0獲得校準的FSEC峰強度來量化。
圖1.不同條件處理TGP的FSEC結果
圖1顯示了cPGAP1、PI-PLC、PI-PLC分別加20、50 ng的cPGAP1以及不加酶處理TGP3的FSEC結果，結果顯示，Zenix-C SEC-300體積排阻色譜柱能夠從游離TGP中分離出來自偶聯(lián)反應的產物(TGP0)，該產物以cPGAP1-、PI-PLC-和劑量依賴的方式出現。
圖2.是否采用PI-PLC處理各冷凍電鏡樣品的FSEC曲線對比
圖2是PI-PLC對不同冷凍電鏡樣品影響的圖譜(單次實驗)。FSEC分析顯示，樣品中有很大一部分TGP3被水解成TGP2，TGP2通過過量的PI-PLC轉化為TGP0。TGP2和TGP3(~30kDa)都攜帶酰基鏈，因此可以形成detergent mcelles形式(~70kDa)，減少了在Zenix-C SEC-300體積排阻色譜柱中的保留時間，從而實現PGAP1底物(TGP3)和最終產物(TGP0)的分離。
實驗結論
該研究設計了一種基于熒光檢測體積排阻色譜(FSEC)的耦合分析方法，采用Zenix-C SEC-300體積排阻色譜柱實現了PGAP1底物(TGP3)和最終產物(TGP0)的分離，可以滿足實驗要求，助力GPI相關分子機制的探究。
產品介紹
賽分科技SEC系列色譜柱，采用特有的表面修飾技術，分離速度快，分辨率高，通用性好，批次重現性強，適用于質控QC放行，也是分析型SEC值得信賴的產品。
圖3.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝
“-C”系列產品，采用賽分科技獨有的固定相修飾工藝，硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層，最大程度減少非特異性相互作用。適用于疏水性較強的樣品，可以減少有機相的使用，“-C”系列產品安全、環(huán)保，讓您的實驗無后顧之憂。
賽分科技SEC系列色譜柱，分離范圍廣，適用于多種細分領域，下表是部分產品的分離范圍。
表1.賽分科技SEC色譜柱分離范圍
上一篇替爾泊肽藥物純化工藝分享
下一篇SEC方法流動相配制指南
