引言
Introduction
單克隆抗體(mAb)的互補決定區(qū)(Complementarity-Determining Region,CDR)中氨基酸的氧化修飾會顯著影響抗體與抗原結(jié)合的能力以及生物學(xué)活性。在2020版中國藥典中,對mAb供試品氧化產(chǎn)物等雜質(zhì)進行定量分析,是單抗制品檢定的重要指標(biāo)之一。近期,賽分科技客戶復(fù)宏漢霖于ACS Pharmacol.Transl.Sci.上發(fā)表相關(guān)文章(*點擊底部左下角“閱讀原文”獲取文章鏈接)。文中介紹了一種基于疏水相互作用色譜(HIC)的方法,用于量化和表征CDR區(qū)域中的甲硫氨酸氧化變體(Met-Ox)。研究人員利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水分析柱及半制備柱,成功分離和富集目標(biāo)單抗的氧化變體。賽分科技HIC色譜柱在異質(zhì)體分離方面效果顯著,不僅適用于抗體的分析和穩(wěn)定性評估,而且對樣品制備和生物學(xué)功能研究提供重要支持。
背景介紹
IgG類抗體是目前臨床治療中最常用的抗體類型之一。對于IgG而言,氧化修飾作為質(zhì)量檢驗的一個重要指標(biāo),在評價抗體的穩(wěn)定性和功能性方面至關(guān)重要,特別是Met-Ox對抗體與抗原之間的親和力有著直接影響。在實際研發(fā)生產(chǎn)中,可采用半制備的方式來分離這些氧化變體,從而進行進一步的體外和體內(nèi)特性研究,以評估抗體性能。
當(dāng)前,測定Met-Ox通常采用C18或PS-DVB基質(zhì)的反相色譜柱進行方法開發(fā),但這種方法往往會導(dǎo)致抗體生物活性受損,不利于后續(xù)實驗。為了解決這個問題,研究人員選擇了賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱,可以有效分離目標(biāo)氧化變體,同時保證產(chǎn)品質(zhì)量和一致性。
文章概述
本研究通過對特定條件下不同時間點(從0.5 h至24 h)處理的目標(biāo)抗體mAb-A進行了系統(tǒng)的研究,考察了氧化處理后其分子量、亞單位構(gòu)象及生物活性的變化。研究發(fā)現(xiàn),隨著氧化時間的增長,mAb-A的分子量逐漸增加,這主要是由于重鏈(HC)上的Met105位點發(fā)生了二硫鍵斷裂導(dǎo)致的氧化反應(yīng)。此外,F(xiàn)(ab')2片段內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了兩個對稱位置的氧化敏感位點,這些位點的氧化使得HIC圖譜出現(xiàn)了多個不同的峰組(PG),證實了Met105為主要的氧化位點。進一步研究表明,雖然Met105位點的氧化并不影響抗原結(jié)合能力,但它明顯降低了mAb-A對PD-1/PD-L1通路的阻斷活性。
氧化變體分析
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 0.5 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 30 μg
圖1. mAb-A樣品分析色譜圖
作為mAb-A的參考藥物(RMP),Keytruda在CDR區(qū)域含有氧化變異體。為了確保mAb-A的質(zhì)量和與RMP相似性,研究人員建立HIC方法對樣品進行了分析,結(jié)果如圖1所示。圖1中,主峰組(MPG)在大約22 - 27 min,峰前組1(PG1)在大約20 - 22 min洗脫。與MPG相比,PG1的洗脫時間更早。
圖2. mAb-A及其氧化變體分析色譜圖(0.25%的tBHP在0,0.5,4和24h)
為了確認(rèn)氧化變異體的存在,研究人員在氧化條件下對mAb-A進行了強制降解,隨后使用HIC方法進行了分析,結(jié)果如圖2所示。與對照樣品相比,隨著氧化程度的增加,MPG逐漸轉(zhuǎn)化為PG1,進而轉(zhuǎn)化為PG2。圖中所示,在氧化0.5 h后,樣品的MPG百分比降低,PG1升高,并觀察到一個新的峰組PG2。在氧化4 h的樣品中,MPG的下降和PG1和PG2的增加更為明顯。在氧化24 h后,MPG和PG1的峰幾乎消失不見,而PG2的峰面積占比達(dá)到94%。
表1. LC-MS/MS Trypsin PTM與HIC色譜法結(jié)果百分比對比
表1列舉了LC-MS/MS Trypsin PTM結(jié)果和從分析HIC色譜法計算出的百分比。兩種方法得出的結(jié)果非常接近,表明HIC色譜分析法可以作為一種快速篩查的有效替代方法。
制備收集
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 10 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 2.0 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 2 mg.
圖3.mAb-A氧化變體HIC分析色譜圖(0.25%的tBHP氧化4 h)
圖3-a.mAb-A氧化變體分級收集
圖3-b.mAb-A氧化變體純度檢測
圖3是對氧化4 h的mAb-A進行分級收集及純度檢測的結(jié)果。其中圖3-a是HIC組分收集示意圖。圖3-b表示將富集的樣品超濾三次,然后進行HIC分析來確定各組分的純度。各組分的分析圖譜與制備圖譜對比,可以看出半制備規(guī)格Proteomix HIC Butyl-NP5色譜柱保持高分辨率,制備的樣品保持高純度。
實驗結(jié)論
綜上所述,研究人員使用賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5分析與制備柱,成功地對目標(biāo)抗體mAb-A的氧化變體進行了分離和富集,制備后的樣品可保持生物學(xué)活性,可用于后續(xù)研究。此方法不僅適用于監(jiān)測mAb的氧化穩(wěn)定性,而且在其他mAb的探索性研究和開發(fā)過程中也具有廣泛的應(yīng)用前景。
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