在11月8日，賽分科技聯(lián)合生物制品圈開(kāi)展“ADC藥物的分析方法開(kāi)發(fā)”線(xiàn)上直播交流活動(dòng)，本次直播對(duì)ADC藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），ADC藥物的不同檢測(cè)方式（包含體積排阻色譜檢測(cè)ADC及抗體片段、聚體，疏水作用色譜對(duì)ADC藥物DAR值檢測(cè)，離子交換對(duì)電荷異質(zhì)性的分析，反相色譜對(duì)ADC藥物純度的檢測(cè)等），及其分析方法優(yōu)化的途徑進(jìn)行了介紹。直播間各位觀眾積極提問(wèn)，主講人結(jié)合自己豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)及技術(shù)積累，做了解答。在此，我們摘錄部分提問(wèn)，與各位分享。
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精選問(wèn)答
1. SEC色譜柱使用有機(jī)試劑作為流動(dòng)相，是否會(huì)導(dǎo)致SEC色譜柱壽命縮短？
答：硅膠基質(zhì)的色譜柱可以耐受70%的有機(jī)相，如果色譜柱使用有機(jī)相體系，那么減少切換鹽相的更換頻率對(duì)延長(zhǎng)色譜柱的壽命是有利的；另一方面，在使用色譜柱時(shí)注意它的一個(gè)保存和維護(hù)，硅膠基質(zhì)的SEC色譜柱在日常維護(hù)可以采用6 M鹽酸胍，單針進(jìn)樣清洗，另外長(zhǎng)期保存的條件建議是50 mM磷酸鹽緩沖液pH 7.0 ，含0.02%疊氮化鈉或者50 mM 磷酸鹽緩沖液pH 7.0，含 20%乙腈。合理的維護(hù)和保存可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。
2. 在檢測(cè)ADC樣品中游離藥物時(shí)，應(yīng)當(dāng)如何進(jìn)行樣品前處理？
答：在做ADC藥物的游離小分子檢測(cè)時(shí)，可以通過(guò)乙腈蛋白沉淀，復(fù)溶之后再檢測(cè)；另外也可以不做變性處理采用SEC色譜柱進(jìn)行直接檢測(cè)，80Å孔徑的Zenix-C SEC-80，可以排阻大分子樣品，成功與游離小分子分離，實(shí)現(xiàn)快速分析。
3. 針對(duì)高DAR值的ADC樣品進(jìn)行SEC檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)主峰前延的情況，可以通過(guò)什么方法改善分離效果？
答：首先考察色譜柱性能是否正常，采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者驗(yàn)證過(guò)的樣品去測(cè)試，確認(rèn)色譜柱拖尾因子是否在正常范圍內(nèi)；如果色譜柱性能正常，那么出現(xiàn)主峰前延的情況下，應(yīng)該是樣品和色譜柱有一定的非特異性吸附，考慮在流動(dòng)相和稀釋液中加入一定比例的鹽或者有機(jī)相去改善次級(jí)相互作用。在優(yōu)化的時(shí)候，加入有機(jī)相的同時(shí)，注意鹽不要析出，另外關(guān)注儀器壓力，加入一定有機(jī)相的時(shí)候需要相對(duì)的降低流速，在升高流速的時(shí)候更小梯度的逐步升高。
4. 在做抗體連接熒光小分子（蛋白），采用HIC方法分離，連接后發(fā)現(xiàn)ADC樣品峰響應(yīng)值低，無(wú)法分離出，該怎么進(jìn)行優(yōu)化？
答：關(guān)注該方法采用的檢測(cè)器，對(duì)于含熒光分子的檢測(cè)，優(yōu)先考慮采用熒光檢測(cè)器（FLD）。再通過(guò)對(duì)比連接色譜柱和不接色譜柱的信號(hào)差異，如果發(fā)現(xiàn)前后差異很大，可能色譜柱存在吸附問(wèn)題；對(duì)于色譜柱吸附，可以在流動(dòng)相中加入一定比例的有機(jī)溶劑，降低次級(jí)相互作用。如果通過(guò)加入有機(jī)溶劑的方式收效甚微，那考慮是否由于疏水作用色譜較強(qiáng)導(dǎo)致，可能需要更換疏水性相對(duì)較弱的色譜柱再進(jìn)行嘗試。
5. 離子交換色譜多孔和無(wú)孔的差異體現(xiàn)在哪些方面？
答：色譜填料是否有孔的差異主要體現(xiàn)在比表面積的差異，有孔的填料相對(duì)而言具有更大的比表面積，相對(duì)而言它的載量會(huì)更高。此外，填料孔徑的大小和樣品分子大小的相對(duì)關(guān)系，對(duì)分離也有影響。無(wú)孔填料是在其微球表面鍵合基團(tuán)，可以通過(guò)延長(zhǎng)間隔臂，減小空間位阻，增加填料所能結(jié)合的官能團(tuán)，從而提高載量。但對(duì)于分析色譜柱而言，載量不是色譜填料考慮的優(yōu)先因素，所以對(duì)于分析柱而言載量小不會(huì)對(duì)分析有什么影響。
6. 對(duì)于離子交換分離，請(qǐng)問(wèn)pH洗脫和鹽梯度洗脫的各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)有哪些？
答：對(duì)于離子交換的兩種洗脫模式，其主要區(qū)別在于：pH洗脫優(yōu)勢(shì)在于快速，對(duì)分析方法優(yōu)化比較快，嘗試幾個(gè)梯度就可以得到比較好的結(jié)果，而它的缺點(diǎn)在于選擇性相對(duì)較少，商用的pH試劑較少，可優(yōu)化的范圍也相對(duì)較窄；鹽梯度洗脫的優(yōu)勢(shì)在于可以多角度、多方向進(jìn)行優(yōu)化，可以調(diào)整鹽的種類(lèi)、鹽濃度，并且對(duì)不同樣品的選擇性可以有一些明顯的改善效果，鹽梯度分析優(yōu)化的不足在于其分析方法優(yōu)化更為復(fù)雜，對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作而言需要配制不同鹽以及不同濃度的鹽，相對(duì)繁瑣。
7. 對(duì)于ADC藥物DAR值分析的時(shí)候，對(duì)于峰歸屬問(wèn)題怎么解決？
答：根據(jù)ADC藥物結(jié)構(gòu)可得，抗體可通過(guò)連接子接入不同個(gè)數(shù)（0~8個(gè)）的細(xì)胞毒分子，需要對(duì)不同的色譜峰進(jìn)行歸屬確認(rèn)，最后可以得到該ADC樣品的平均DAR值。如果分析的時(shí)候采用HIC模式進(jìn)行分析的，那么該方法通常采用較高的鹽濃度作為流動(dòng)相，不利于直接連接質(zhì)譜檢測(cè)，可以考慮將不同的色譜峰收集，在進(jìn)行LCMS的檢測(cè)，更有利于確定不同的色譜峰。另外也可嘗試采用RP的分離方式去進(jìn)行峰分離和檢測(cè)，有利于MS兼容。
ADC藥物結(jié)構(gòu)示意圖
8. 請(qǐng)問(wèn)為什么pl>7的抗體ADC更多選擇陽(yáng)離子交換？強(qiáng)陽(yáng)和弱陽(yáng)離子交換應(yīng)該怎么選擇？
答：一般對(duì)于樣品pI（等電點(diǎn)）大于7，優(yōu)先選擇陽(yáng)離子色譜柱分離；強(qiáng)陽(yáng)和弱陽(yáng)離子的交換官能團(tuán)是不同的，弱陽(yáng)通常是羧酸基團(tuán)，強(qiáng)陽(yáng)是磺酸基團(tuán)，對(duì)應(yīng)不同的pKa值，因而對(duì)于不同樣品的選擇性也不同。對(duì)于弱陽(yáng)交換的離子色譜，在流動(dòng)相pH與固定相pKa相差2個(gè)單位的時(shí)候它的選擇性相對(duì)更好。離子交換色譜的選擇是兩方面考慮的，即流動(dòng)相pH和樣品pI，流動(dòng)相的pH值比樣品pI小的時(shí)候，采用陽(yáng)離子交換；流動(dòng)相的pH值比樣品pI大的時(shí)候，采用陰離子交換。實(shí)際分析時(shí)還需要注意ADC樣品在不同pH值的穩(wěn)定性，注意避免引起Linker的斷裂。
9. ADC藥物進(jìn)行疏水色譜分析時(shí)，樣品需要使用流動(dòng)相A（高鹽流動(dòng)相）稀釋嗎？
答：在進(jìn)樣前，需要確認(rèn)溶劑對(duì)樣品疏水性的影響，一般會(huì)用高鹽（流動(dòng)相A）溶解或者稀釋樣品，以增加進(jìn)樣前樣品的疏水性，避免樣品直接流穿；另外需注意樣品在高鹽時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)（進(jìn)樣前將樣品用流動(dòng)相A稀釋一下，看是否產(chǎn)生沉淀）進(jìn)行驗(yàn)證，如果產(chǎn)生沉淀，建議將流動(dòng)相A的濃度降低些。
10. 請(qǐng)問(wèn)在選擇SEC柱子系列的時(shí)候，要考慮抗體或者ADC的哪些特性？才能避免盲目選擇？
答：對(duì)于SEC的選擇主要有三個(gè)點(diǎn)，其一，就是填料孔徑的選擇，主要與ADC分子量或者分子尺寸直接相關(guān)，明確它的排阻限；其二，考慮填料的粒徑和色譜柱的尺寸規(guī)格，同等孔徑規(guī)格下，更小粒徑色譜柱可以帶來(lái)更高的分辨率；第三個(gè)方面，考察色譜柱與樣品的一個(gè)非特異性吸附問(wèn)題，賽分科技可以提供超低非特異性吸附的色譜柱，可以選擇SRT-C/Zenix-C/Unix-C系列的色譜柱產(chǎn)品用于ADC類(lèi)疏水性較高的藥物進(jìn)行分析。
11. ADC測(cè)DAR值HIC法系統(tǒng)適用性如何設(shè)定？
答：ADC樣品DAR值分析系統(tǒng)適用性的確定主要關(guān)注ADC樣品的DAR值及RSD的測(cè)試情況，顯示不同DAR值的峰需要在系統(tǒng)適用性樣品中體現(xiàn)，此外根據(jù)RSD確定該色譜峰的重現(xiàn)性。對(duì)于色譜峰分離度及柱效需要結(jié)合具體的樣品考察，前期研究的時(shí)候可以重在積累數(shù)據(jù)，之后再確定一個(gè)合適的分離度和柱效的標(biāo)準(zhǔn)。
本次直播感謝各位觀眾的熱情參與，
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之后賽分科技會(huì)持續(xù)推出關(guān)于工業(yè)純化和分析色譜的直播內(nèi)容，
敬請(qǐng)期待
