基因治療作為全新的治療方式，近年來發(fā)展迅速，從最初的罕見病常用藥物的開發(fā)逐步擴(kuò)展到腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、血液疾病等多個(gè)治療領(lǐng)域，其中以腺相關(guān)病毒（Adreno-Associated Virus, AAV）作為載體的基因?qū)胂到y(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。隨著基因藥物研發(fā)的深入，對產(chǎn)品質(zhì)量控制日趨成熟，國內(nèi)外法規(guī)、指南相繼出臺(tái)，推動(dòng)基因治療行業(yè)的發(fā)展。賽分科技積極開發(fā)AAV質(zhì)量控制解決方案，在此，介紹用以分析不同血清型AAV樣品的空殼率及聚體、游離DNA等雜質(zhì)分析方法，以供參考。
背景介紹
除了目的樣品正確組裝的實(shí)心衣殼（full capsids）, AAV樣品在制備過程中存在多種雜質(zhì)（圖1），其中包含空殼（empty）樣品、部分組裝（partially-filled）、AAV衣殼聚體，游離DNA等，此類物質(zhì)不僅會(huì)增加免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)還會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，影響藥物療效，因而對該類物質(zhì)應(yīng)采取相應(yīng)措施進(jìn)行控制。美國藥典委員會(huì)（USP）提出病毒載體疫苗質(zhì)量控制草案中提出推薦分析方法，其中目前對于樣品空殼率的檢測，主要有三種檢測方式，分別為分析型超速離心（AUC），電鏡檢測（TEM），以及離子交換（AEX-HPLC）分析，其中AEX-HPLC分析有利于快速定量分析，方法簡便適應(yīng)性強(qiáng)，并且可以將此方法擴(kuò)大到樣品純化中，有利于純化方法的開發(fā)。
圖1 AAV樣品相關(guān)雜質(zhì)示意圖
去年，賽分科技客戶美國加州拜瑪琳制藥（BioMarin）在自然雜志子刊《Scientific Reports》上發(fā)表文章，介紹了體積排阻色譜柱分離AAV衣殼單體、二聚體、多聚體的方法，采用雙波長（λ=260 nm，λ=280 nm）檢測，不僅可以計(jì)算雜質(zhì)峰比例，通過不同波長下峰面積的比值還可鑒定色譜峰類型：單體實(shí)心衣殼與二聚體的的A260/A280比率基本一致，約為 1.34；空心衣殼的比值約為 0.6。另外，A260/A280比率為1.8為純的DNA色譜峰，A260/A280為2.0時(shí)為純RNA色譜峰。使用該方法，在保證AAV樣品與聚體、游離DNA雜質(zhì)分離情況下，可簡便快速對實(shí)心及空心衣殼、游離DNA及RNA進(jìn)行鑒別或者定量分析。
賽分科技采用Proteomix POR-Q色譜柱分離AAV樣品空殼及實(shí)心樣品，可用于空殼率檢測。AAV SEC-5是賽分科技專為AAV樣品檢測開發(fā)設(shè)計(jì)，用于分析不同血清型AAV樣品聚體及游離DNA樣品分析，具有超高分辨率，助力AAV樣品質(zhì)量控制。
AAV5空殼-實(shí)心樣品檢測方法
Column: Proteomix POR-Q (15 µm, 1000 Å ,4.6×50 mm)
Mobile Phase: A: 20 mM BTP, pH9.5; B: A+500 mM TMAC, pH9.5
Flow rate: 1.5 mL/min
Column Temperature: Ambient
Injection volume: 30 µL
Detector: UV檢測器波長分別為260 nm和280 nm，串聯(lián)FLD檢測器Excitation 280 nm, Emission 330 nm
圖2 AAV5 空殼率檢測色譜圖
該分析方法采用賽分科技Proteomix POR-Q（4.6×50 mm）陰離子交換色譜柱對AAV5樣品空殼率進(jìn)行檢測，色譜柱具有大孔徑（1000 Å），具有高分辨率和高回收率。色譜圖（圖2）表明空殼樣品與實(shí)心樣品可以完全分開，根據(jù)A260/A280峰面積比可以推測先出峰的樣品為empty或者partially-filled樣品，后出峰樣品為實(shí)心AAV。根據(jù)色譜峰面積計(jì)算矯正因子后可以定量測定空殼樣品占比。
AAV8聚體、游離DNA分析檢測方法
Column:AAV SEC-5 (5 µm, 4.6x300 mm)；SRT SEC-500 (5 µm, 4.6x300 mm)；SRT SEC-1000 (5 µm, 4.6x300 mm)對比分析
Mobile Phase: A: 1.8X DPBS; C: 10% Ethanol
Flow rate: 0.35mL/min
Column Temperature: 25℃
Injection volume: 20 µL
Detector:UV檢測器波長分別為260 nm和280 nm，串聯(lián)FLD檢測器Excitation 280 nm, Emission 330 nm
圖3 AAV8實(shí)心樣品檢測色譜圖及色譜峰數(shù)據(jù)
對AAV樣品主峰前三個(gè)小峰進(jìn)行分析，根據(jù)峰面積比，推測前三個(gè)小峰分別是游離DNA以及AAV聚體雜質(zhì)，主峰峰面積比A260/A280為1.28鑒別為實(shí)心AAV樣品。
圖4 AAV8 實(shí)心樣品檢測放大色譜圖
圖5 AAV8 空心樣品檢測放大色譜圖
同樣根據(jù)色譜峰積分信息，峰面積A260/A280推測雜質(zhì)峰為RNA樣品，主峰為空殼AAV樣品。
從三款色譜柱AAV實(shí)心（圖4）及空殼樣品（圖5）對比分析色譜圖表明AAV SEC-5對該AAV8樣品相比于SRT SEC-500及SRT SEC-1000孔徑分別為500Å和1000Å兩款色譜柱，可以將主峰前雜質(zhì)峰更好的分離，有利于AAV樣品質(zhì)量控制。AAV SEC-5色譜柱為AAV樣品檢測開發(fā)的專用色譜柱，適應(yīng)AAV樣品分子尺寸及樣品特點(diǎn)，因而對比常規(guī)體積排阻色譜柱在AAV樣品分析中具有明顯優(yōu)勢。
將AAV SEC-5色譜柱采用同樣分析方法應(yīng)用于AAV2樣品的分析，同樣發(fā)現(xiàn)該色譜柱具有較高的分辨率，成功將AAV主峰前樣品雜質(zhì)進(jìn)行分離（圖6）。
圖6 AAV2樣品分析色譜圖
*AAV空殼率檢測離子交換色譜柱Proteomix POR-Q以及AAV聚體等雜質(zhì)分離專用色譜柱AAV SEC-5均已上線，歡迎訂購
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