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      Polar MC-IMAC 填料是一種金屬親和填料,適用于純化帶有組氨酸 ( His ) 標(biāo)簽的重組蛋白,這類重組蛋白廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。該填料以親水性聚甲基丙烯酸酯微球?yàn)榛|(zhì),粒徑為 30 μm 或 60 μm,孔徑為 800 Å,具有較高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。填料表面具 有高度的親水性,最大程度地避免了與生物類樣品的非特異性吸附。在親水性表面,以專有連接物鏈接了能螯合多價(jià)金屬離子的羧酸基團(tuán)。

      Polar MC-IMAC 填料有兩種類型 : 游離酸型(Polar MC30-CA Excel 或 Polar MC60-CA Excel,羧酸 ) 和螯合鎳離子型 ( Polar MC30-Ni Excel 或Polar MC60-NiExcel)。游離酸型可用于金屬離子去除,也可根據(jù)客戶要求定制他金屬離子型填料。這兩種類 型的 IMAC 填料結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

    填料結(jié)構(gòu)

    圖1a. Polar MC30/60-CA Excel的化學(xué)結(jié)構(gòu)

    1.png

    圖1b. Polar MC30/60-Ni Excel的化學(xué)結(jié)構(gòu)

    2.png

      該填料高度穩(wěn)定,可耐受 0.5 M NaOH 接近 100次清洗循環(huán)。螯合金屬離子的填料能在 0.1 M 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的清洗條件下不損失金屬離子,因此每次使用后無需再補(bǔ)充金屬離子。這兩種填料都可以散裝、 FPLC 柱或常規(guī) HPLC 柱的形式提供。

    技術(shù)參數(shù)
    填料類型 Polar MC30-CA Excel, Polar MC30-Ni Excel
    Polar MC60-CA Excel, Polar MC60-Ni Excel
    包裝條件 50%(v/v)懸浮液,在20%乙醇中保存
    基體 親水性聚甲基丙烯酸酯
    粒徑 20 ~ 45 μm (平均30 μm)
    45 ~ 90 μm (平均60 μm)
    孔徑 800 Å
    pH穩(wěn)定范圍  基礎(chǔ)填料Polar MC-CA Excel:1-13
    金屬離子螯合填料 Polar MC-Ni Excel:1-13
    載量 Polar MC30-CA Excel >120 μeq. carboxylic group /mL
    Polar MC30-Ni Excel 40-60 μeq.Ni++ /mL
    Polar MC60-CA Excel >100 μeq. carboxylic group /mL
    Polar MC60-Ni Excel 40-60 μeq.Ni++ /mL
    組氨酸標(biāo)記蛋白(His-protein)載量 Polar MC30-Ni Excel, ~20 mg/mL
    Polar MC60-Ni Excel, ~15 mg/mL
    操作溫度 ≤40 °C
    操作壓力 ≤30 MPa (30 bar)
    流動(dòng)相兼容性 水溶液,或水和乙腈、丙酮或甲醇的混合物。
    常用緩沖液:磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和醋酸鹽,也與6M鹽酸胍、8M尿素、0.1 M EDTA、10 mM DTT相容
    線性流速 ≤1800 cm/h

    應(yīng)用案例

      將 300 mL 組氨酸標(biāo)記蛋白粗品上樣到以 PolarMC60-Ni Excel 裝填 15x220 mm 賽分Generik FPLC柱(貨號(hào)202000-1525-AF)中。用上樣緩沖液清洗后,靶蛋白用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸鈉緩沖液(pH8),以 7.5 mL/min 的流速洗脫(圖 2)。

    2.jpg

    圖2. 組氨酸標(biāo)記蛋白在Polar MC60-Ni Excel上的純化實(shí)例

    上樣:溶解在25 mM磷酸鹽(pH8) + 0.5M氯化鈉緩沖液的組氨酸標(biāo)記蛋白粗品以5.0 mL/min的流速上樣;

    淋洗:再用25 mM磷酸鹽(pH8) + 0.5 M氯化鈉緩沖液洗滌色譜柱;

    洗脫:用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸鹽(pH8) + 0.5 M氯化鈉緩沖液洗脫組氨酸標(biāo)記蛋白, 并收集純化組分、 淋洗液及上樣流穿液。

      收集的餾分用10%三甘氨酸SDS-Pages確認(rèn)( 圖3 )。

    2.jpg

    圖3. SDS-Pages分析從圖2所示純化中收集的組分

    泳道1:分子量階梯

    泳道2:組氨酸標(biāo)記蛋白粗品

    泳道3:樣品上樣后的流穿液

    泳道4:上樣后清洗色譜柱的淋洗液

    泳道5:洗脫靶蛋白的0.5 M咪唑洗脫液

      IMAC 填料在 90 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液清洗后表現(xiàn)出耐堿性和可重復(fù)使用性 ( 圖 4)。用0.5 M NaOH 溶液以 0.25 倍柱體積 /min 的流速進(jìn)行 30 次循環(huán)洗滌,總接觸時(shí)間為 2 小時(shí)后,重復(fù)使用該填料純化相同的組氨酸標(biāo)記蛋白,結(jié)果表 明填料的結(jié)合性能保持不變。

    2.jpg

    圖4. 耐堿性和可重復(fù)使用性實(shí)驗(yàn)

    泳道 1:分子量階梯

    泳道 2:組氨酸標(biāo)記蛋白粗品

    泳道 3:收集的流穿液作為樣品上樣到新色譜柱上

    泳道 4:用新鎳柱洗脫靶蛋白的洗脫液

    泳道 5:用 30 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱體積 /min 的流速清洗,總接觸時(shí)間達(dá) 2 小時(shí)后,收集到的流穿液

    泳道 6:用 30 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液清洗鎳柱后,靶蛋白的洗脫液

    泳道 7:用 60 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱體積 /min 的流速清洗,總接觸時(shí)間達(dá) 4 小時(shí)后,收集到的流穿液

    泳道 8:用 60 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液清洗鎳柱后,靶蛋白的洗脫液

    泳道 9:用 90 倍柱體積的 0.5 M NaOH 鈉溶液以 0.25 柱體積/min 的流速清洗,總接觸時(shí)間達(dá) 6 小時(shí)后,收集到的流穿液泳道 10:用 90 倍柱體積的 0.5 M NaOH 鈉溶液清洗鎳柱后,靶蛋白的洗脫液

    應(yīng)用圖譜

    填料種類 粒徑 貨號(hào)
    Polar MC30-CA Excel 30 μm 270530800
    Polar MC30-Ni Excel 30 μm 270630800
    Polar MC60-CA Excel 60 μm 270560800
    Polar MC60-Ni Excel 60 μm 270660800

    預(yù)裝柱規(guī)格為1、4.2、5 mL,包裝規(guī)格為5 L以下及5 L、10 L、50 L

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