重組膠原蛋白是采用基因工程技術(shù)在合適的宿主中表達(dá)并翻譯的蛋白或類似膠原蛋白的多肽，相對(duì)于天然提取的膠原蛋白，具有批次間穩(wěn)定、組分可控、生物安全性高和可編輯修飾等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于美容護(hù)膚，皮膚、眼科修復(fù)與骨修復(fù)等醫(yī)學(xué)保健領(lǐng)域。據(jù)行業(yè)研究報(bào)告顯示，我國重組膠原蛋白市場預(yù)計(jì)到2027年將達(dá)到千億規(guī)模。重組膠原蛋白行業(yè)已成為功能性護(hù)膚市場、醫(yī)用敷料市場的黃金賽道。
背景簡介
膠原蛋白由脯氨酸、甘氨酸以及羥脯氨酸等構(gòu)成一級(jí)結(jié)構(gòu)，氨基酸通過α螺旋使膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，最后3條α鏈經(jīng)過左手螺旋構(gòu)象形成三螺旋結(jié)構(gòu)的原膠原，如圖1展示。根據(jù)國家藥監(jiān)局對(duì)外發(fā)布的《重組膠原蛋白生物材料命名指導(dǎo)原則》，可將重組膠原蛋白分為 3 類：①重組人膠原蛋白；②重組人源化膠原蛋白（醫(yī)療器械中最主流的重組膠原蛋白類型）；③重組類膠原蛋白（主要用于化妝品領(lǐng)域）?！吨亟M人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YY/T1888-2023）文件對(duì)重組人源化膠原蛋白的質(zhì)量控制給出了明確的指導(dǎo)，對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP）殘量、細(xì)胞內(nèi)毒素等雜質(zhì)要求提供了明確的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。
圖1. 膠原蛋白結(jié)構(gòu)的形成*
重組膠原蛋白的常見表達(dá)體系為大腸桿菌和酵母，大腸桿菌表達(dá)體系具有遺傳背景清晰、發(fā)酵成本低、生產(chǎn)周期短和效率高等優(yōu)點(diǎn)，酵母表達(dá)體系具有安全性高、發(fā)酵成本低和產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)。賽分科技根據(jù)兩種表達(dá)體系特點(diǎn)開發(fā)了大腸桿菌體系純化方案和酵母體系純化方案，助力重組膠原蛋白企業(yè)實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)、高效率的規(guī)?；a(chǎn)。
大腸桿菌體系純化方案
大腸桿菌表達(dá)體系中的主要雜質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的宿主蛋白、宿主核酸以及內(nèi)毒素等，常用親和層析、離子交換層析等方法去除。如圖2的工藝示意圖，對(duì)于胞內(nèi)可溶表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物，首先將菌體進(jìn)行破碎、澄清過濾等樣品前處理；對(duì)于有His標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物，一般選擇Ni親和層析進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的捕獲，待酶切切除標(biāo)簽后，可采用流穿模式再用Ni親和層析去除His標(biāo)簽、未酶切的蛋白等；精純則采用離子交換去除內(nèi)毒素等雜質(zhì)，同時(shí)進(jìn)一步提升樣品純度。賽分科技瓊脂糖基質(zhì)的Ni親和填料Agarosix MC90-NTA Ni具有高載量、高回收率的特點(diǎn)，適用于含His標(biāo)簽的重組蛋白的捕獲以及酶切后去除標(biāo)簽，配合陰離子交換填料Monomix Mab60-Q，有效純化重組人源化膠原蛋白，得到滿足質(zhì)量要求的目標(biāo)蛋白樣品。
圖2. 大腸桿菌體系制備重組膠原蛋白工藝示意圖
親和捕獲應(yīng)用案例
某重組人源化膠原蛋白樣品，表達(dá)體系為大腸桿菌，分子量約為70 KDa。經(jīng)Agarosix MC90-NTA Ni純化后，從圖3電泳圖可知，流穿液、洗雜、再生中的含有極少的目的蛋白，一步回收率在90%以上，洗脫峰（lane 6）實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的富集，有效去雜蛋白，純化后樣品純度顯著提升。
圖3. Agarosix MC90-NTA Ni純化圖譜和電泳圖
（1. Marker; 2.原樣; 3. FT; 4. Wash1; 5. Wash2; 6. Elution; 7. CIP）
酵母體系純化方案
畢赤酵母作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)具有目的蛋白表達(dá)量高、純化方法簡單、不受內(nèi)毒素影響等特點(diǎn)，是膠原蛋白重組表達(dá)的優(yōu)勢(shì)宿主菌株。下游純化時(shí)可通過離子交換層析捕獲結(jié)合疏水層析精純，得到高純度重組膠原蛋白產(chǎn)物。賽分科技推薦Agarosix MC90-MMC復(fù)合陽離子交換填料或Monomix HC60-SP陽離子交換填料捕獲，結(jié)合Polar MC30-HIC Phenyl疏水填料精純，兩步純化后目的蛋白SEC純度在95%以上，滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。
圖4. 酵母體系制備重組膠原蛋白工藝示意圖
應(yīng)用案例
對(duì)某重組人源化膠原蛋白發(fā)酵液進(jìn)行下游純化，首先用Agarosix MC90-MMC填料進(jìn)行陽離子交換層析，捕獲目的蛋白，之后用Polar MC30-HIC Phenyl進(jìn)行疏水層析精純，兩步純化后SEC純度達(dá)到97%，電泳純度達(dá)到99%。
01 MMC捕獲方案
Agarosix MC90-MMC陽離子交換層析捕獲目的蛋白，如圖5純化圖譜及電泳圖，流穿液（lane 3）中基本無目的蛋白，洗雜后大分子雜蛋白被成功去除（lane 4），僅剩余少部分降解片段和小分子雜質(zhì)（lane 5），洗脫后的目的蛋白純度明顯提升且收率較高。
圖5. Agarosix MC90-MMC純化圖譜及電泳分析
（1. Marker; 2.原樣; 3. FT; 4. Wash; 5. Elution）
02 疏水層析精純方案
捕獲后的樣品用Polar MC30-HIC Phenyl進(jìn)行疏水層析精純，小分子雜質(zhì)與目的蛋白分開完全，洗脫合管（lane 5）的SEC純度達(dá)到97%，電泳純度達(dá)到99%，雜蛋白幾乎完全去除。
圖6. Polar MC30-HIC Phenyl純化圖譜及電泳分析
（1. Marker; 2.原樣; 3. FT；4. Wash; 5. Elution合樣）
小結(jié)
Agarosix MC90-NTA Ni填料的蛋白載量高，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，配合Monomix Mab60-Q陰離子交換填料，有效純化大腸桿菌體系重組人源化膠原蛋白（點(diǎn)擊鏈接閱讀，了解更多Agarosix MC90-NTA Ni產(chǎn)品信息）。酵母體系推薦Agarosix MC90-MMC復(fù)合陽離子交換填料捕獲和Polar MC30-HIC Phenyl疏水填料精純，兩步純化后目的蛋白SEC純度在95%以上，滿足高純度、高收率的生產(chǎn)要求。
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*參考文獻(xiàn)：
[1] BERISIO R, et al. Crys tal structure of the collagen triple helix model [(Pro-Pro-Gly)10]3 [J]. Protein Science, 2002, 11(2): 262-270.
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